Экспрессия опухолевых клеток

Самое важное по теме: "экспрессия опухолевых клеток" с профессиональной точки зрения. Мы собрали, агрегировали и представили в доступном виде всю имеющуюся по теме информацию и предлагаем ее к прочтению.

Экспрессия опухолевых клеток

Экспертное заключение – доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии лечебного факультета РГМУ М.В. Самойлов

Учебное пособие выполнено в рамках инновационной образовательной программы Российского университета дружбы народов, направление «Комплекс экспортоориентированных инновационных образовательных программ по приоритетным направлениям науки и технологий»

[2]

Содержание

ПРИКЛАДНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГИСТОХИМИИ Тема № 4. Значение клеточных белков в оценке гистогенеза опухолей Тема № 5. Рецепторные белки в неизмененных и опухолевых клетках Тема № 6. Белки – маркеры клеточного цикла Тема № 7. Факторы апоптоза и пролиферации

Тема № 8. Белковые молекулы, характеризующие клеточную адгезию Тема № 9. Иммуногистохимия ангиогенеза

ПРИКЛАДНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГИСТОХИМИИ

Для иммуногистохимического анализа опухолей и их метастазов применяется широкий спектр маркеров, к которым можно отнести:

  • тканеспецифические белки – белки промежуточных филаментов (ПФ),
  • компоненты базальной мембраны,
  • рецепторы, молекулы клеточной адгезии и др.

Для иммуногистохимической верификации опухолей человека используют антитела к белкам ПФ.

Промежуточные филаменты вместе с микротрубочками и микрофиламентами составляют цитоскелет всех клеток эукариотов. Свое название ПФ (диаметр 10 нм) получили из-за того, что они тоньше микротрубочек (диаметр 24 нм), но толще микрофиламентов (диаметр 7 нм). Основная функция ПФ – создание внутриклеточного каркаса, механическое поддерживание плазматической мембраны в местах соприкосновения с другими клетками и внеклеточным веществом, а также поддержание ядерной оболочки. ПФ не подвергаются циклическим изменениям, как это происходит с микрофиламентами и микротрубочками. В клетке ПФ достаточно стабильны, даже после обработки клеток детергентами они остаются интактными, в то время как большинство микротрубочек и микрофиламентов в клетках деполимеризируются до растворимых форм.

Все промежуточные филаменты разделены на шесть групп:

  1. кислые цитокератины (молекулярная масса 40-64 кДа), по каталогу цитокератинов R. Moll (1998) они имеют порядковые номера № 9-20;
  2. нейтрально-основные цитокератины, № 1-8 (молекулярная масса 52.5-68 кДа);
  3. виментин (молекулярная масса 58 кДа), располагается в мезенхимальных клетках: фибробластах, остеоцитах и остеобластах, хондроцитах, шванновских клетках, меланоцитах кожи, лейкоцитах, плазматических клетках, эндотелии сосудов, некоторых эпителиальных клетках; десмин мышечных клеток (молекулярная масса 54 кДа) – в клетках скелетных мышц, кардиомиоцитах, гладкомышечных клетках висцеральных органов и кровеносных сосудов; глиальный фибриллярный кислый белок (молекулярная масса 55 кДа) – маркер астроцитарных клеток; периферин распределяется в нейронах периферической нервной системы;
  4. белки нейрофиламентов (молекулярная масса 68, 145 и 220 кДа) и альфа-интернексин;
  5. ядерные ламины формируют оболочку ядра, их экспрессия связана со степенью дифференцировки клетки;
  6. белок нестин экспрессируется в стволовых клетках нейроэпителия.

Иммуногистохимическое изучение с помощью моноклональных антител белков ПФ в опухолевых клетках различных эпителиальных и мезенхимальных новообразований показало, что в них стойко сохраняются те белки, которые характерны для ПФ нормальных клеток, явившихся источником развития данной опухоли, причем сохранность белков не зависит от степени анаплазии опухолевых клеток и зрелости новообразования в целом. Таким образом, выявление ПФ в опухолевых клетках с помощью специфических антител к различным ПФ позволяет определить эпителиальное, мезенхимальное или нейроэктодермальное происхождение опухолевых клеток, поставить диагноз и назначить адекватное лечение.

Цитокератины – маркеры различных типов эпителия

Наиболее многочисленной группой белков ПФ являются цитокератины. Цитокератины – белки промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток. Клетки различных эпителиев имеют разные молекулярные формы цитокератина.

В настоящее время выявлено 20 типов цитокератинов CK1-CK20. Спектр цитокератинов в эпителиальных клетках зависит от типа дифференцировки, положения клетки в эпителиальном пласте.

В клетках простого однослойного эпителия экспрессируется CK8 и CK18. Эти низкомолекулярные цитокератины выявляются в клетках печени, поджелудочной железы, большинстве эндокринных клеток и эпителиальных клетках проксимальных извитых канальцев почек. Эпителиальные клетки желудочно-кишечного тракта, желчных протоков и протоков поджелудочной железы, легочных альвеол, эндометрия и собирательных трубочек почек также содержат CK7 и CK19. Нормальные клетки фолликулов щитовидной железы экспрессируют CK7, но не содержат CK19 и CK20. В базальном слое кожи CK20 окрашивает эндокринные клетки Меркеля. Железистый эпителий, с выраженным базальным или миоэпителиальным клеточным слоем (базальные и миоэпителиальные клетки молочной железы, потовых и слюнных желез, предстательной железы) экспрессирует CK5, CK14 и CK17, в то время как в секреторном эпителии выявляются цитокератины CK8, CK18, CK7, CK19.

В многослойном плоском эпителии базальный слой может экспрессировать CK5 и CK14, представляя цитокератины высокого молекулярного веса, а также CK19 (за исключением кожи). Средний и поверхностный слои неороговевающего многослойного плоского эпителия слизистых оболочек экспрессируют CK4 и CK13, в эпидермисе экспрессируются CK1 и CK10.

В переходном эпителии во всех клетках выявляются цитокератины CK8, CK18, CK19 и CK7, в то время как поверхностные «зонтичные» клетки специфически экспрессируют CK20.

В мезотелии выявляются цитокератины CK8, CK18, CK19, CK7 и цитокератины многослойного эпителия CK5, CK14, CK17.

Таким образом, присутствие цитокератинов в клетке является признаком, который может быть использован для идентификации эпителия: каждому виду эпителиальных клеток с определенной функцией и локализацией соответствует характерный набор цитокератиновых полипептидов.

Цитокератины в диагностике опухолевых заболеваний

В новообразованиях человека установлены определенные закономерности экспрессии белков ПФ.

Злокачественные опухоли из эпителия экспрессируют цитокератины, выявляемые и в неизмененных клетках того же гистогенеза. Аденокарциномы в основном экспрессируют цитокератины однослойного эпителия – CK8, CK18, CK19 и часто CK7. В клетках переходноклеточного рака и рака из клеток Меркеля сохраняются биохимические свойства нормальных клеток и выявляется CK20. В анапластических клетках плоскоклеточного рака встречаются CK5, CK6, CK14, CK16 и CK17.

Неэпителиальные опухоли, как правило, цитокератин-негативны, однако некоторые мезенхимальные опухоли, такие как лейомиома, рабдомиосаркома, меланома, шваннома и анапластическая крупно-клеточная лимфома могут экспрессировать цитокератины CK8, CK18, CK19. Эпителиоидная саркома, хондрома и амелобластома экспрессируют цитокератины простого эпителия (CK8, CK18, CK19). Синовиальная саркома и злокачественная мезотелиома экспрессируют цитокератины однослойного эпителия, однако в области расположения дифференцированных клеток возможна экспрессия и высокомолекулярных цитокератинов, характерных для многослойного плоского эпителия.

Цитокератины – важные маркеры для иммуногистохимической классификации недифференцированных опухолей.

Читайте так же:  Тремор рук у новорожденных

Для выявления цитокератинов в опухолевых клетках часто используются так называемые общие цитокератины (клоны AE1/AE3 и MNF 116, Dako) – антитела с широкой специфичностью к различным эпителиям, они могут применяться для дифференциальной диагностики рака с большинством неэпителиальных опухолей. Антитела к общему цитокератину можно использовать для выявления микрометастазов или разбросанных опухолевых клеток в лимфатических узлах и костном мозге, инфильтрирующего роста при раках желудка и молочной железы.

Преимущественная экспрессия цитокератинов многослойного плоского эпителия высокого молекулярного веса, таких как CK5 и CK13, в опухолях характеризует плоскоклеточную дифференцировку и помогает выявить слабо дифференцированные плоскоклеточные опухоли. CK8, CK18 и CK19 могут экспрессироваться как в аденокарциномах, так и в плоскоклеточных раках, в таких случаях наличие CK5 и отсутствие экспрессии CK7 позволяет предположить плоскоклеточный рак.

Из внутримозговых опухолей цитокератины экспрессируют: папилломы хориодного сплетения и злокачественные папилломы хориодного сплетения, некоторые менингиомы, в то время как глиомы и низкодифференцированные нейроэктодермальные опухоли CK-негативны.

Антитела к плоскоклеточному эпителию CK5 выявляют базальные эпителиальные и миоэпителиальные клетки и таким образом могут помочь в выявлении инвазии при раке предстательной и молочной желез.

Для переходноклеточного рака мочевого пузыря экспрессия CK13 и CK20 является хорошим прогностическим признаком. Начало экспрессии CK14 в переходноклеточном раке свидетельствует о плоскоклеточной дифференцировке и неблагоприятном прогнозе. В папиллярных уротелиальных опухолях нормальный (поверхностный) тип экспрессии CK20 характерен для нерецидивирующих опухолей и может быть использован для дифференциальной диагностики между инвазивными и неинвазивными опухолями.

Экспрессия CK7 без коэкспрессии CK20 характерна для аденокарциномы легких, молочной железы, эндометрия и щитовидной железы, а также для немуцинозной аденокарциномы яичников и злокачественной мезотелиомы.

Типичным антигенным паттерном для рака толстого кишечника является экспрессия цитокератинов, характерных для эпителия тонкого кишечника, CK20 и отсутствие экспрессии CK7.

Экспрессия CK7 и CK20 характерна для переходноклеточного рака мочевого пузыря, муцинозного рака яичников и аденокарцином желудка, желчных путей и поджелудочной железы.

В свою очередь, гепатоцеллюлярный рак, рак предстательной железы, почечноклеточный рак и мелкоклеточный рак легких не экспрессируют CK7 и CK20.

С.В. Петров, Н.Т. Райхлин (2000) на первом этапе, при диагностике анапластических опухолей, предлагают использовать 4 типа антител – к виментину, цитокератинам (CK-Pan), белку S-100 (представляющему семейство Са 2+ -связывающих белков, которые обнаружены в клетках различных тканей) и общему лейкоцитарному антигену. Если ИГХ реакция будет везде положительной или везде отрицательной – это расценивается как артефакт. Если положительная реакция отмечается только на виментин, то ставится диагноз саркома (либо семинома). При положительной реакции на виментин и белок S-100, эта опухоль оценивается как липосаркома или меланома. Если положительная окраска на виментин сочетается с реакцией на общий лейкоцитарный антиген – и в редких случаях низкомолекулярные цитокератины, то предполагается наличие лимфомы. При положительной реакции на цитокератины и в виде исключения на белок S-100 – виментин, можно думать о низкодифференцированном раке, герминоме и о других опухолях.

На втором этапе удается разделить цитокератин-позитивные низкодифференцированные опухоли на переходноклеточные, плоскоклеточные, нейроэндокринные раки, аденокарциномы и мезотелиому.

Если положительная реакция на цитокератины, характерные для плоского эпителия (CK5, CK13), сочеталась с положительной реакцией на цитокератины однослойного эпителия (CK8, CK18, CK19, CK7), то это – переходноклеточный рак или некоторые протоковые аденокарциномы. Если иммунофенотип опухоли был CK5 и CK14 (+), а CK8, CK18 (-), то это – плоскоклеточный рак.

При положительной реакции на широкий спектр цитокератинов и виментина, это – мезателиома либо синовиальная или эпителиоидная саркома, либо некоторые раки щитовидной железы, почки и другие редкие раки.

В случае коэкспрессии CK8, CK7, CK18 с общим лейкоцитарным антигеном предполагается анапластическая крупноклеточная лимфома, диагноз которой уточняется с помощью антител к CD-30, антигену ALCL.

Если положительная реакция на CK8, CK18, CK19 и CK7 сочеталась с отрицательной реакцией на CK5, CK6, CK14, CK16 и CK17, то эта опухоль являлась аденокарциномой, которая в дальнейшем тестировалась на раковоэмбриональный антиген (РЭА). Выраженная реакция на РЭА свидетельствует о раке толстого кишечника, желудка, поджелудочной железы, желчных протоков.

Слабая реакция на РЭА наблюдается при раке мочевого пузыря, молочной железы, шейки матки, легкого (при плоскоклеточном крупноклеточном варианте). Отрицательная реакция на РЭА наблюдается в клетках аденокарциномы простаты, почки, печени, яичников, щитовидной железы, эндокриноклеточных раковых опухолях.

Третий этап имеет цель определить органную локализацию анапластической опухоли с иммунофенотипом РЭА (+), CK8, CK18, CK19, CK7 (+) и проводится с помощью органоспецифических маркеров.

При раке простаты выявляется специфический антиген простаты (PSA) и щелочная фосфатаза, специфичная для простаты (PAP), при раке щитовидной железы – тиреоглобулин, в клетках печеночноклеточного рака – альфа-фетопротеин, рака яичника – СА-125, хориоэпителиомы – хорионический гонадотропин. Клетки эндокринных раков экспрессируют нейрон-специфическую энолазу (NSE), хромогранин и др. Положительные на виментин и отрицательные на общий цитокератин (CK-Pan) мягкотканые опухоли являются новообразованиями мезенхимальной природы (лимфомы, саркомы), некоторыми нейрогенными опухолями, либо меланомами.

Анапластические опухоли, дающие окраску на виментин подразделяются на лимфомы (Т- и В-клеточные), меланому (положительная реакция с белком S-100), миогенные саркомы (позитивные реакции на гладкомышечный актин, десмин, миоглобин), ангиосаркомы (реагирующие с антителами к фактору VIII свертывания крови, CD31), злокачественную фиброзную гистиоцитому (экспрессирует альфа-1-антитрипсин, CD68, лизоцим, альфа-1-антихимотрипсин, иногда белок S-100), фибросаркому, реагирует с виментином и CD34).

Экспрессия генов циркулирующих опухолевых клеток у пациентов с раком молочной железы

Диагностические средства для прогнозирования прогноза у пациентов, страдающих раком молочной железы (БК), нуждаются в дальнейшем улучшении. Новые технологические достижения, такие как профилирование генов циркулирующих опухолевых клеток (CTC), могут помочь выявить новые прогностические маркеры в клинических условиях. Кроме того, модели экспрессии генов CTC могут предоставить важную информацию о механизмах метастаза опухолевых клеток.

Мы провели анализ в реальном времени — ПЦР и мультиплекс-ПЦР после иммуномагнитного разделения КТК. Были проанализированы образцы периферической крови (ПБ) из 63 пациентов с раком молочной железы различных стадий и сопоставлены с контрольной группой из 14 здоровых людей. После обратной транскрипции мы выполнили мультиплексную ПЦР с использованием праймеров для генов ga733.3, muc-1 и c-erbB2. Mammaglobin1, spdef и c-erbB2 анализировали с использованием ПЦР в реальном времени.

Читайте так же:  Бросила девушка психолог

гиперэкспрессия ga733.2 была обнаружена в 12,7% случаев рака молочной железы, muc-1 в 15,9%, мгb1 в 9,1% и spdef в 12,1%. В этом исследовании c-erbB2 не обнаружил существенной корреляции с BC, возможно, из-за экспрессии с высокой экспрессией. Помимо анализа одиночных генов, дополнительно анализировались профили генов. Высокие корреляции с БК были обнаружены в анализах одного гена ga733.2 и muc-1 и в анализе профиля генов ga733.3 * muc-1 и GA7 ga733.3 * muc-1 * mgb1 * spdef.

В нашем исследовании показано, что одиночные гены ga733.3, muc-1 и профили гена ga733.3 * muc-1 и ga733.3 * 3muc-1 * mgb1 * spdef могут служить маркерами для обнаружения CTC в BC. Многоленковые анализы показали высокий положительный уровень у пациентов с ВС. Наше исследование показывает, что анализ не одного гена, а тонкие образцы множественных генов приводят к повышению точности и низкой потере специфичности при выявлении случаев рака молочной железы.

Было показано, что циркулирующие опухолевые клетки (CTC) играют важную роль в биологии опухоли рака молочной железы (БК) и могут иметь прогностическую ценность у пациентов с метастатическим заболеванием [1]. Основные характеристики опухоли могут определить ее способность метастазировать [2,45 -48]. Слабые клеточные клетки приводят к распространению опухолевых клеток через кровеносные и лимфатические сосуды [3]. Опухолевые клетки, входящие в кровоток, зависят от микроокружения органов, чтобы иметь возможность колонизировать ткани и размножаться [4-7].

Измененная экспрессия гена ответственна за трансформированное поведение опухолевой ткани [8-11] и может отличать CTC от здоровых клеток [12,13]. Тем не менее, остается неясным, какие гены допускают специфическое обнаружение КТК. Кроме того, межличностные вариации уровней экспрессии генов, обусловленные определенным генетическим полиморфизмом, дополнительно бросают вызов этим исследованиям.

Относительно небольшое количество КТК в ПБ больных раком привело к разработке улучшенных систем обнаружения и обогащения клеток [1,14]. Исследовано несколько подходов иммуномагнитного обогащения CTC в образцах PB [15-17]. Бусины, покрытые моноклональными антителами (mcAb) против эпителиальных поверхностных белков, обеспечивают точное обнаружение и экстрагирование клеток эпителия и карциномы из PB. Впоследствии обогащенный CTC может быть обнаружен с помощью полимеразной цепной реакции обратной транскриптазы (RTPCR) измененных маркерных генов, предположительно предполагаемых для прогнозирования опухоли. В нескольких исследованиях были проанализированы различные генетические маркеры для выявления КТК.

Французское исследование показало более экспрессию муцина 1 (muc-1), гена, кодирующего полиморфный эпителиальный поверхностный фосфопротеин. Это исследование включало как пациентов с доброкачественной болезнью молочной железы, так и продвинутого ВС и показало значительную корреляцию между наличием muc1-позитивных клеток и стадией опухоли [18]. Эти результаты были воспроизведены Felton et al. показывая аналогичные результаты у пациентов с прогрессирующим заболеванием [19].

ga733.3 (TACSTD1, Ep-CAM), ген, ответственный за адгезию эпителиальных клеточных клеток путем кодирования поверхностного гликопротеина, рассматривается как присутствующий исключительно на эпителиальных клетках [20]. Его использование в качестве маркера опухолей было спорным образом обсуждено [21]. Тем не менее Rao et al. [22] может продемонстрировать снижение экспрессии ga733.2 в CTC по сравнению с первичными опухолевыми клетками. Это может указывать на то, что снижение уровня этого белка имеет решающее значение для потери клеточной адгезии, которая позволяет опухолевой клетке получить доступ к кровообращению. В частности, Watson et al. задокументировала сверхэкспрессию SCGB2A2 (mammaglobin 1; MGB-1), полипептидного члена семейства матоглобинов, в BC [23,24]. Определение Mammaglobin1-RT-PCR в PB было предложено в качестве дополнения к маркерам опухоли сыворотки Lin et al. так как чувствительность подошвы mgb1 в анализах RT-PCR считалась не убедительной. Дальнейшие исследования сравнивали положительность свежей ткани BC и PB [25]. Кроме того, корреляция между частотой сверхэкспрессии mgb1 в PB и стадией опухоли BC описана Cerveira et al. [26].

Гадерсохи и др. описано сильное выражение spdef в RT-PCR-анализе тканей BC. Дальнейшие исследования показали превосходную опухолевую ассоциацию этого маркера по сравнению с другими связанными с раком молекулами [27-30].

Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы охарактеризовать CTC в PB пациентов BC, применяя коммерчески доступную систему, нацеленную на вышеупомянутые гены.

Это исследование было рассмотрено и одобрено комитетом по институциональным вопросам человека. Клиенты BC и здоровые люди, служащие в качестве контроля, предоставляли информированное согласие на все процедуры.

Наше исследование включало 63 пациентов с СК и 14 здоровых контролей. Возраст пациентов варьировался от 33 до 81 года, медиана 60 лет. Возраст контроля варьировал от 24 до 61 с медианой 41,5 лет. Пятьдесят пациентов с первым диагнозом (ФД) БК и 13 имели рецидивирующую болезнь (РД) во время сбора ПБ. Заболевание в соответствии с Американским объединенным комитетом по борьбе с раком (AJCC) суммировано в таблице 1. Средний интервал между хирургическим лечением и регистрацией составил 2,5 месяца для ФД и 60 месяцев для рецидивной болезни (РД).

В этом исследовании было зарегистрировано 63 пациента с раком молочной железы с первой диагностикой (FD) или рецидивирующей болезнью (RD). G представляет собой стадию заболевания в соответствии с Американским объединенным комитетом по раку (AJCC).

Образцы венозной крови собирали в EDUT Vacutainer Tubes (Becton Dickinson, NJ USA) и обрабатывали в течение 2 часов с использованием метода иммуномагнитного разделения Adnagen Breast Cancer Select Kit (ABCS) (Adnagen, Langenhagen, Germany) в соответствии с инструкциями производителя. Этот метод основан на иммунологическом подборе пролитых негематологических клеток с использованием антител, направленных против эпителиальных и, вероятно, злокачественных поверхностных антигенов. Вкратце, комбинация антител загружается магнитными частицами и сохраняется в натриевой кислоте. Использовались антитела против ga733.3 и два разных антитела против эпитопов муцина-1.

Перед нанесением образцов крови иммуномагнитные гранулы подвергали трем этапам стирки в пробирке объемом 1,5 мл с использованием 1 мл PBS (Gibco Invitrogen, Karlsruhe Germany). Каждый шаг содержал разделение шариков в системе магнитных стержней (MPC-S Dynal). Затем к 5 мл образцов крови добавляли 100 мкл иммуномагнитных гранул без каких-либо добавок. Образцы, включая шарики, вставляли в ротатор трубки в течение 2 часов при 20 об / мин (об / мин) и комнатной температуре (RT).

Используя большую магнитную систему (MPC-L Dynal Invitrogen, Karlsruhe Germany), на стороне MPC-L накапливались нагруженные бусиной клетки. Затем супернатанты удаляли осторожно и добавляли PBS (5 мл). Добавление PBS, удерживание MPC-L и удаление супернатантов повторяли два раза. В конце этой стадии комплексы бисера-клеток ресуспендировали в 1 мл PBS и вводили в MPC-S. Супернатанты удаляли еще раз и комплексы ресуспендировали в 200 мкл буфера для лизиса / связывания ABCS. Наконец, образцы снова вставлялись в MPC-S. На этот раз супернатанты, включая клеточные лизаты с нативной мРНК, сохраняли и хранили при -20 ° C.

Читайте так же:  Диагноз алалия у ребенка что это

ABCD применяли для стадий RT и ПЦР хранящихся клеточных лизатов. Этот набор содержит лизис / связывающий буфер, олиго (dT) -25 шарики, буферы A и B, трис-HCl и Primermix. Кроме того, используемые комплекты включали Sensiscript Reverse Transcription Kit и HotStarTaq Mastermix Kit (Qiagen) и рекомбинантный РНК (RNAse-Inhibitor Promega).

Вкратце, олиго (dT) -слойные шарики (ABCD Dynabeads), нацеленные на определенную мРНК, вставляли в MPC-S и удаляли супернатанты. Бусины промывали в буфере для лизиса / связывания. Эту стадию повторяли один раз, и 20 мкл динамолита затем аликвотировали каждому образцу клеточных лизатов. Смесь клеточных лизатов и динамоидов помещали на ротатор трубки в течение 10 минут при 20 об / мин и RT. Образцы вставляли в MPC-S и удаляли супернатанты.

Затем образцы последовательно промывали буфером А, В и трис-HCl и каждый раз вставляли в MPC-S. Супернатанты удаляли. Шаги стирки с буфером А и В обрабатывали дважды, в то время как трис-HCl применяли один раз.

После окончательной элиминации супернатантов мы ресуспендировали мРНК-шарики-комплексы в 29,5 мкл свободной от РНК воды и инкубировали их в термомиксере в течение 5 минут при 650 об / мин и 50 ° С.

Готовая RT-смесь состояла из 4 мкл 10 × буфера RT, 4 мкл dNTP, 2 мкл RT (Qiagen, Hilden Germany) и 0,5 мкл ингибитора РНКазы (Promega, Mannheim Germany) для каждого образца 29,5 мкл мРНК / шариковых комплексов. В качестве контроля использовали RNAsefree воду. Транскрипцию проводили в термоциклере (Perkin Elmer 9600, 2 ° C / секунду) со следующей программой:

37 ° С в течение 60 минут — шаг обратной транскриптазы

93 ° С в течение 5 минут — шаг инактивации

суспензию кДНК хранили на льду.

Мультиплексная ПЦР (mPCR) была выполнена с использованием 25 мкл Hotstar Taq Mastermix (Qiagen, Hilden-Germany), 13 мкл дистиллированной воды, 4 мкл PrimerMix Breast Detect (ABCD) и 8 мкл суспензии кДНК, RT-контроль, вода в качестве отрицательного контроля или положительного контроля (ABCD) соответственно. Primermix представляет собой тройную комбинацию праймеров для ga733.2 (383 bp), muc-1 (293 bp), c-erbB2 (270 bp) и β-актина (114 bp) в качестве контрольного гена41. Общий объем 50 мкл вводили в термоциклера (Perkin Elmer 9600, 2 ° C / сек) и ПЦР проводили со скоростью 2 ° С в секунду в соответствии со следующей программой:

1. 95 ° C в течение 15 минут — активация Taq

2. 94 ° C в течение 1 минуты

3. 60 ° C в течение 1 минуты

Видео удалено.
Видео (кликните для воспроизведения).

4. 72 ° C в течение 1 минуты

5. 72 ° C в течение 10 минут — конечное удлинение

Стадии 2-4 повторяли в течение 35 циклов. Наконец, суспензии ДНК хранили при -20 ° С. Продукты ПЦР анализировали в биоанализаторе (2100 — биоанализатор Agilent, CA, США) с помощью ДНК-чипов (версия 25-1000 bp). Результаты регистрировали в соответствии с флуоресценцией и путем конверсии в абсолютной концентрации кДНК (нг / мкл). Как упоминалось ранее, β-актин был выбран в качестве гена для поддержания дома.

Выражение c-erbB2, mgb1 и spdef определяли количественно с использованием высокопроизводительной RT-PCR в реальном времени с использованием велосипеда ABI PRISM® 7900 HT (AME Bioscience, Toroed Norway). GUSBL1 (бета-подобная глюкуронидаза 1) была выбрана в качестве домашнего хозяйства. Зонды были заказаны как «готовые к заказу» анализы экспрессии гена праймера зонда TaqMan (Hs00170433_m1 для c-erbB2, HS00267190_m1 для mgb1, HS0017942_m1 для spdef, Applied Biosystems, CA, USA). В каждом анализе содержались пара амплификационных праймеров и дополнительные олигонуклеотидные зонды Tqq-Man MGB с флуоресцентным красителем 6-FAM, связанным с 5′-концевым и одним темным гасителем на 3′-конце с небольшим связующим белком канавки, увеличивая толщину зонда (Tm). Гены были отобраны в соответствии с часто появляющимися выражениями генов в наших предыдущих данных (гены Affymetrix Chip HgU133A, 22283 в 83 профилях рака молочной железы по сравнению с 5 нормальными профилями молочной железы) [31].

ПЦР проводили в 96-луночных планшетах с общим объемом 25 мкл, содержащим универсальный ПК-концентратор TaqMan Universal (dNTP, буфер, ROX и AmpliTaq-Gold). Протокол термического циклирования по умолчанию (как рекомендовано ABI) использовался для всех целевых генов и эталонного гена (начальная стадия 15 мин при 95 ° C для активации AmpliTaqGold и цикл амплификации 15 секунд при 95 ° C и 1 мин при 60 ° С в течение 40 циклов). Гены определяли количественно путем определения номеров пороговых циклов (ct). Один общий порог был задан вручную на ранней экспоненциальной фазе увеличения флуоресценции и использовался для всех генов в течение одного эксперимента. Были включены элементы «Transcriptase-minus» и «water-only».

Статус Her-2 / neu у 84,1% наших пациентов определялся обычно с использованием иммуногистохимии (антитело против Her-2 / neu: поликлональное DAKO 1: 250). Результаты окрашивания подразделяются на четыре уровня в соответствии с рекомендацией производителя. Высокоположительный синтез Her-2 / neu (≥ 2+) наблюдался в 20 случаях БК (20/53, 37,7%).

Диагностика экспрессии PD-L1

Что представляет собой лиганд программируемой клеточной гибели PD-L1?

  • PD-L1 – трансмембранный белок, лиганд к рецептору PD-1. При связывании с рецептором PD-1 на цитотоксических лимфоцитах блокирует их цитотоксическую активность
  • В норме участвует в физиологическом механизме подавления аутоиммунных реакций
  • При экспрессии PD-L1 опухолевыми клетками данный лиганд участвует в механизмах ускользания опухоли от иммунного контроля

Роль PD-L1 в патогенезе немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ)

Сигнальный путь иммунной контрольной точки PD-1 включает рецептор PD-1 и его лиганды PD-L1 и PD-L2. Наиболее важная роль в ускользании опухоли от иммунного ответа отводится взаимодействию рецептора PD-1 и лиганда PD-L1.

Обоснование оценки PD-L1 экспрессии как предиктивного маркера при НМРЛ

Читайте так же:  Как понравится мальчику в лагере

Длительная антигенная стимуляция, часто наблюдаемая при опухолевых заболеваниях, приводит к устойчивой экспрессии рецептора PD-1 на T- лимфоцитах и повышению экспрессии лигандов PD-L1 на опухолевых клетках. Таким образом, опухоль может ускользать от иммунного ответа посредством гиперэкспрессии лиганда PD-L1, который, связываясь с рецептором PD-1 на T-лимфоцитах, нарушает их цитотоксическую активность.

Зачем определять статус PD-L1 экспрессии?

Тест для определения экспрессии PD-L1 позволяет выделить группу пациентов с наибольшей вероятностью ответа на терапию ингибиторами иммунных контрольных точек.

В исследованиях ингибиторов PD-1/PD-L1 у больных распространенным НМРЛ было продемонстрировано, что более высокая эффективность данных препаратов наблюдается при более высоком уровне экспрессии PD-L1 опухолевыми клетками.

Каким пациентам необходимо определение уровня PD-L1 экспрессии?

Анализ экспрессии PD-L1 рекомендуется выполнять всем пациентам с распространенным НМРЛ (плоскоклеточным и неплоскоклеточным). Частота PD-L1 позитивного НМРЛ (экспрессия PD-L1 ≥ 1% опухолевых клеток) в популяции больных составляет 60-65%, высокопозитивные опухоли (экспрессия PD-L1 на ≥ 50% опухолевых клеток) наблюдаются в 23-25% случаев. Уровень экспрессии PD-L1 не зависит от возраста, пола, гистологического типа НМРЛ.

Методы определения экспрессии PD-L1

Экспрессия PD-L1 определяется методом иммуногистохимии. Оценка осуществляется путем подсчета соотношения опухолевых клеток с позитивным окрашиванием мембраны к общему количеству опухолевых клеток (TPS – tumor proportion score), результат выражается в процентах от 0 до 100.

В России зарегистрирован диагностический набор для определения экспрессии PD-L1 производства Dako – PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Тестирование проводится на платформе Dako Autostainer Link 48.

Экспрессия PD-L1 на опухолевых клетках

По уровню экспрессии PD-L1 выделены следующие группы: отрицательная ( 1%) экспрессия, в группе с позитивной экспрессией выделена подгруппа с выраженной экспрессией (≥50%).

Для тестирования может быть использован операционный или биопсийный материал первичной или метастатической опухоли, фиксированный в формалине и залитый в парафин. Обязательным требованием является наличие в исследуемом образце не менее 100 опухолевых клеток.

Определение уровня экспрессии PD-L1 и персонализированный подход к выбору терапии, основанный на результатах иммуногистохимического тестирования, позволяет сделать лечение пациентов с немелкоклеточным раком легкого более эффективным.

Алгоритм тестирования

О программе определения экспрессии PD-L1 у пациентов с немелкоклеточным раком легкого

  • Тестирование в рамках программы проводится на всей территории страны.
  • Отправка материала и тестирование проводятся бесплатно для врачей, лечебных учреждений и пациентов.
  1. Zitvogel L et al. Tumor Immunol. 2006;6(10):715–727. 2. Vesely MD, Schreiber RD. Ann NY Acad Sci. 2013;1284(1):1–5
  2. May KF Jr et al. In: Prendergast GC et al. Cancer Immunotherapy. 2nd ed. Elsevier; 2013:101–113.
  3. Pardoll DM. Nat Rev Cancer. 2012;12(4):252–264. 2. McDermott DF, Atkins MB. Cancer Medicine. 2013;2(5):662–673.
  4. Garon EB et al. N Engl J Med. 2015;372(21):2018–2028
  5. Mino-Kenudson M. Programmed cell death ligand-1 (PD-L1) expression by immunohistochemistry: could it be predictive and/or prognostic in non-small cell lung cancer? Cancer Biol Med. 2016; 13:157-170. doi: 10.20892/j.issn.2095-3941.2016.0009
  6. Dako Denmark A/S. PD-L1 IHC 22C3 pharmDx™ Interpretation Manual. 2. DakoDenmark A/S. ImmunohistochemicalStaining Methods. Sixth Edition, 2013.
  7. Hirsch FR et al. J Thoracic Oncol. 2017;12(2):208–222.
  8. RatcliffeMJ et al. Clin Cancer Res. 2017;23(14):3585–3581.
  9. RatcliffeMJ et al. Clin Cancer Res. 2017;23(14):3585–3581.
  10. IlieM et al. PLoSONE. 2017;12(8):1
  11. Herbst RS et al. Lancet. 2016;387(10027):1540–1550.
  12. Reck M et al. N Engl J Med. 2016;375(19):1823–1833.
  13. Garon EB et al. N Engl J Med. 2015;372(21):2018–2028.
  14. Hirsch FR, Bunn PA. Lancet Oncol. 2009;10(5):432–433.
  15. Kwak EL et al. N Engl J Med.2010;363(18):1693–1703.

Контактная информация:

Телефон горячей линии проекта
«Молекулярная диагностика»
8-800 100 17 36

(звонок бесплатный)
c 7:00 до 18:00 по МСК.

Общероссийская общественная организация
«Российское общество клинической онкологии» (RUSSCO)

РФ, 127051, Москва, ул. Трубная, д.25 к.1, 7 эт.
Тел.: +7 (499) 686-02-37
E-mail:

Экспрессия виментина в опухолевых клетках раков различных органов и разного гистологического строения

Выявление полной эпителиально-мезенхимальной трансформации с экспрессией виментина. Способность опухоли к инвазии и метастазированию. Эмбриональный гистогенез органа. Особенности канцерогенеза различных форм опухолей. Молекулярные изменения в клетках.

Подобные документы

Свойства опухоли, причины их возникновения. Исследования на канцерогенную активность. Роль наследственности в развитии онкозаболеваний. Пауль Эрлих — основатель химиотерапии. Схема роста и метастазирования опухолей. Взаимодействие иммунитета и опухоли.

презентация, добавлен 05.04.2016

Понимание молекулярных механизмов озлокачествления опухолей и их метастазирования – ключ к лечению этих гетерогенных и устойчивых новообразований. Клеточная программа, которая позволяет изменять форму клетки, ее адгезивные свойства и подвижность.

статья, добавлен 24.02.2019

Уточнение роли допплерографической составляющей комплексного ультразвукового исследования мягких тканей при подозрении на наличие опухоли. Особенности доброкачественных и злокачественных новообразований мягких тканей различных гистологических групп.

статья, добавлен 08.06.2018

Отличия структуры злокачественных опухолей у детей. Онкологические теории, объясняющие причины возникновения опухолевых процессов в детском возрасте. Свойства эмбрионального и ювенильного видов заболевания, сбор анамнеза и методы медицинской визуализации.

реферат, добавлен 18.12.2010

Ознакомление с общей классификацией опухолей детского возраста по Т.Е. Ивановской: тератом, эмбриональных опухолей и опухолей «взрослого» типа. Изучение типов тканевых пороков развития — гамартии и хористии. Рассмотрение основных прогоном человека.

курсовая работа, добавлен 24.10.2017

Понятие и виды опухолей. Различия доброкачественных и злокачественных новообразований. Гистогенетическая классификация опухолей. Биологические основы канцерогенеза. Характеристика наследуемых онкологических синдромов. Стадии и степень злокачественности.

статья, добавлен 03.07.2013

Классификация опухолей яичников. Патогенез и лечение кистомы яичников. Эпителиальные опухоли. Описание муцинозных, эндометриоидных, светлоклеточных гормонпродуцирующих и герминогенных новообразований. Признаки опухоли Бреннера. Виды химиотерапии.

реферат, добавлен 10.01.2017

Процесс передачи генетической информации. Экспрессия гена и ее регуляция. Генетические дефекты и эндокринные болезни. Молекулярные основы патогенеза эндокринных опухолей. Задержка роста, обусловленная дефицитом гонадотропных, СТГ, ТТГ и АКТГ гормонов.

реферат, добавлен 03.07.2010

Изучение процессов пролиферации и апоптоза. Исследование экспрессии Ki-67 и Casp-3 в биоптатах гиперпластических полипов желудка. Уровень экспрессии Ki-67 в эпителиоцитах и клетках собственной пластинки в полипах с умеренной и тяжелой дисплазией эпителия.

статья, добавлен 27.12.2016

Изучение лучевого и комбинированного лечения злокачественных опухолей органа зрения. Рассмотрение понятия доброкачественных опухолей. Лучевое и комбинированное лечение некоторых неопухолевых заболеваний органа зрения, его методические возможности.

Определение рецептора PD-L1 в ткани опухоли методом ИГХ

PD-L1− это химическое вещество, лиганд, экспрессируемый опухолевыми клетками. На поверхности иммунокомпетентных клеток (Т-лимфоцитов) присутствует белок PD-1 (сокр. от Programmed cell Death-1). Когда Т-лимфоцит пытается прикрепиться к раковой клетке, чтобы разрушить ее, протеин PD-1 связывается с имеющимся на ее поверхности лигандом PD-L1. В результате функционирование иммунных клеток ингибируется: тормозится пролиферация, не происходит выделение цитокинов, губительных для злокачественных клеток. Таким образом, раковая опухоль отражает иммунную атаку и продолжает свой дальнейший рост. Оценка уровня экспрессии молекулы PD-L1 рассматривается как потенциальный биомаркер прогноза эффективности и продолжительности лечения злокачественных новообразований.

Читайте так же:  Психология темпераменты личности

Лиганд PD-L1, лиганд рецептора программируемой клеточной смерти 1.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Образец ткани (в парафиновом блоке).

Общая информация об исследовании

Иммуногистохимическое исследование — метод идентификации специфичных антигенных свойств ткани, основанный на обработке срезов маркированными специфическими антителами к выявляемому веществу, которое в данной ситуации служит антигеном. Современные системы визуализации комплекса антиген-антитело относятся к новому поколению фермент-опосредованных методов окраски и позволяют проводить иммунологические исследования с высокой специфичностью и чувствительностью.

В онкологии иммуногистохимическое исследование помогает выявить молекулярные структуры опухолевых клеток, ассоциированные со степенью дифференцировки, способностью их к инвазии и метастазированию, чувствительностью к химиотерапии, иммунотерапии, с особенностями течения и прогнозом заболевания у конкретного пациента; определить источник метастазирования при невыясненном первичном очаге, прогноз опухолевого процесса на дооперационном этапе и коррекцию схемы лечения; выбрать адекватную патогенетическую и таргетную терапию, определить наличие в опухолевых клетках различные точки приложения.

[3]

Иммуногистохимическое исследование проводится для определения наличия в опухолевых клетках различных рецепторов, точек приложения препаратов, направленных для их лечения. Механизм иммунотерапии рака заключается в том, что препарат позволяет иммунитету «увидеть» опухоль и уничтожить её. Ответственные за «видимость» опухоли белки PD-1 — PDL-1 и PDL-2 — в достаточном количестве присутствуют не во всех опухолях, именно поэтому одним пациентам иммунотерапия помогает, а другим нет. Для того чтобы отобрать пациентов, которым показана иммунотерапия, проводится определение наличия экспрессии PD-1 и его лиганд PDL-1 и PDL-2. Чаще всего определение гиперэкспрессии белка PD-1 и его лиганд необходимо при меланоме, немелкоклеточном раке легкого, раке желудка и раке почки. При наличии экспрессии PD-1 и его лиганд PDL-1 и PDL-2 показано применение иммунотерапии препаратами Пембролизумабом (Кейтруда), Ниволумабом (Опдиво), Атезолизумабом (Тецентрик).

Доказано, что антитела к белкам PD-1 и PD-L1 борются с раком путем высвобождения Т-клеток организма, особого типа иммунных клеток. Исследователи Stanford University School of Medicine доказали, что эта терапия также борется с раковыми клетками совершенно другим способом, направляя иммунные клетки, называемые макрофагами, для поглощения и пожирания раковых клеток.

PD-1 — это клеточный рецептор, который играет важную роль в защите организма от сверхактивной иммунной системы. Т-клетки, которые являются иммунными клетками, учатся выявлять и уничтожать поврежденные или больные клетки и иногда могут ошибочно нападать на здоровые клетки, что провоцирует аутоиммунные заболевания, такие как волчанка или рассеянный склероз. PD-1 — это то, что называется иммунным чекпойнтом, рецептор белка, который подавляет очень активные Т-клетки, так что они имеют меньше шансов атаковать здоровые ткани.

Не так давно исследователи обнаружили, что раковые клетки научились использовать эту иммунную защиту для своих собственных целей. Опухолевые клетки разворачивают производство PD-L1-белков, которые распознаются PD-1-рецепторами, ингибируя атаку Т-клеток на опухоли. Больные раком лечатся антителами, блокирующими PD-1-рецепторы или фиксирующимися на обязательном партнере PD-L1, чтобы выключить «противоуничтожающий» сигнал и позволить Т-клеткам атаковать.

Также было обнаружено, что активация PD-1 ингибирует антираковую активность других иммунных клеток, макрофагов, и, когда PD-1 или PD-L1 рецепторы блокируются антителами, это заставляет эти макрофагиальные клетки атаковать рак.

В современной онкологии иммуногистохимическое исследование, в частности определение рецептора PD-L1 в ткани опухоли, играет важнейшую роль, так как при помощи этого онкологи определяют наличие тех или иных факторов в опухоли, которые позволяют грамотно и адекватно составить дальнейшее лечение пациента и говорить о прогнозах заболевания.

Для чего используется исследование?

  • Иммуногистохимия позволяет выявить гистологическую и нозологическую принадлежность опухоли. С помощью этого исследования определяется класс новообразования для проведения иммунотерапии.
  • Иммуногистохимия позволяет определиться с тактикой лечения. В частности, этот метод исследования позволяет выявить чувствительность опухолевых клеток к воздействию препаратов иммунотерапии.
  • С помощью иммуногистохимии врачи определяют резистентность опухоли к некоторым группам химиотерапевтических препаратов.

Когда назначается исследование?

[1]

  • Анализ материала, взятого во время биопсии, для подбора иммунотерапии.
  • Анализ материала, взятого во время операции, для подбора иммунотерапии.

Что означают результаты?

Заключение о позитивности/негативности опухоли по рецептору PD-L1.

Избыточная экспрессия PD-L1 выявляется в клетках более чем 50% опухолей человека, причем наиболее характерна для следующих новообразований:

— глиобластома и смешанная глиома (в 100% случаев),

— назофарингеальная карцинома (68-100%),

— множественная миелома (93%),

— опухоли мочевого пузыря (28-100%),

— немелкоклеточный рак легкого (35-95%),

— аденокарцинома кишечника (53%),

— гепатоцеллюлярная карцинома (45-93%),

— рак яичника (33-80%),

— рак поджелудочной железы (39%),

— злокачественные опухоли желудка и пищевода (42%).

Повышенная экспрессия PD-L1 в опухоли ассоциирована с неблагоприятным прогнозом при различных типах рака, включая рак почки, рак мочевого пузыря, рак пищевода, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак печени, рак яичников.

Видео удалено.
Видео (кликните для воспроизведения).

Кто назначает исследование?

Источники


  1. Энциклопедия семейной жизни (комплект из 2 книг). — М.: Отечество, 2010. — 825 c.

  2. Альбисетти, Валерио Нам хорошо вместе / Валерио Альбисетти. — М.: Паолине, 2019. — 160 c.

  3. Рубин, Гретхен Проект Счастье. Мечты. План. Новая жизнь / Гретхен Рубин. — М.: Эксмо, 2013. — 512 c.
  4. Вуль, Феликс Путешествие в любовь. Энциклопедия / Феликс Вуль. — М.: Сталкер, 2011. — 416 c.
  5. Хоментаускас Семья глазами ребенка / Хоментаускас. — М.: Рама Паблишинг, 2010. — 441 c.
Экспрессия опухолевых клеток
Оценка 5 проголосовавших: 1

ОСТАВЬТЕ ОТВЕТ

Please enter your comment!
Please enter your name here